提摩太生長於路司得,父為希臘人,母為猶太人(徒十六1)。他自幼受外祖母羅以及母親友尼基影響,熟習舊約聖經(提後一5,三15)。但從其母與希臘人通婚,及提摩太在孩童時未受割禮等事,顯出他們非出自嚴格律法主義家庭,因而容易接受保羅的信息。
他可能是在保羅第一次傳教旅程中(約A.D.47),在路司得由保羅帶領信主,並且被稱為保羅屬靈的兒子(林前四17;提前一2;提後一2)。也因此,提摩太能如此熟悉保羅首次旅程中所遭遇的苦難(提後三11)。由於他十分長進,為人可靠,得到所屬社群的稱讚,保羅便揀選他一同參與第二次佈道旅程的工作(徒十六1~3,約A.D.51),並且得到當地教會長老的任命作主聖工,保羅也親自參加了那次隆重的「按手禮」(提前一18,四14;提後一6),此後提摩太便與保羅到處宣教,成為親密的同工(羅十六21;帖前三2)。
提摩太與保羅一同來到歐洲傳福音,可能在到達腓立比時奉命留下工作,然後在庇哩亞歸隊,並與西拉在庇哩亞扶助那剛成立的教會(保羅先抵雅典;徒十七10~15),後來在雅典與保羅相會(帖前三1~2)。以後又被差回帖撒羅尼迦去鼓勵、造就那邊的教會。及至保羅離開了雅典並開始在哥林多傳道之時,西拉與提摩太再一同「從馬其頓來」與保羅同工(徒十八1、5;帖前三6)。當保羅兩次從哥林多寫信給帖撒羅尼迦教會時,也都特別提到提摩太的名字(帖前一1;帖後一1)。
在第三次佈道旅程中(約A.D.53/54~57/58),提摩太與保羅在以弗所工作許久,從以弗所保羅又差他從陸路去馬其頓和哥林多(徒十九21~22;林前四17,十六10)。後來,又回到馬其頓和保羅會合(林後一1),此後隨同保羅到哥林多(羅十六21),與其他同工隨保羅回馬其頓,再先到特羅亞等候保羅(徒二十3~5)。之後,大概也跟保羅一起到了耶路撒冷(林前十六3)。再來的一段時間,聖經就未再提到提摩太的事蹟,直到保羅首次在羅馬坐監,兩人又再度有親密的屬靈接觸(腓一1;西一1;門1)。當保羅預料自己不久將被釋放時,他告訴腓立比信徒,要差遣提摩太先到他們那裡去(腓二24、29)。
接著又一段資料空白,直到保羅從羅馬監獄獲釋,重返亞西亞、馬其頓時,曾吩咐提摩太留在以弗所負責選拔教會領袖及牧養信徒的工作(約A.D.62)。由於提摩太年輕(提前四12),生性寡言怯懦(林前十六10;提後一6~7),且健康不佳(提前五23),面對重任和異端的危機,難免力有不逮。
因此,保羅在再訪以弗所之前,先寫提摩太前書(約A.D.63)給提摩太,對他多方鼓勵。當羅馬皇帝尼祿逼迫基督徒(約A.D.66),保羅因此再度被囚於羅馬獄中。他自覺沒有獲釋希望,面對殉道的可能性(提後一8、16,四6~8),遂寫信給遠在以弗所的提摩太,盼望他趕來相會,並給予這位年輕牧者有關個人生活及事奉的囑咐。