提摩太生長於路司得，父為希臘人，母為猶太人（徒十六1）。他自幼受外祖母羅以及母親友尼基影響，熟習舊約聖經（提後一5，三15）。但從其母與希臘人通婚，及提摩太在孩童時未受割禮等事，顯出他們非出自嚴格律法主義家庭，因而容易接受保羅的信息。
他可能是在保羅第一次傳教旅程中（約A.D.47），在路司得由保羅帶領信主，並且被稱為保羅屬靈的兒子（林前四17；提前一2；提後一2）。也因此，提摩太能如此熟悉保羅首次旅程中所遭遇的苦難（提後三11）。由於他十分長進，為人可靠，得到所屬社群的稱讚，保羅便揀選他一同參與第二次佈道旅程的工作（徒十六1～3，約A.D.51），並且得到當地教會長老的任命作主聖工，保羅也親自參加了那次隆重的「按手禮」（提前一18，四14；提後一6），此後提摩太便與保羅到處宣教，成為親密的同工（羅十六21；帖前三2）。
提摩太與保羅一同來到歐洲傳福音，可能在到達腓立比時奉命留下工作，然後在庇哩亞歸隊，並與西拉在庇哩亞扶助那剛成立的教會（保羅先抵雅典；徒十七10～15），後來在雅典與保羅相會（帖前三1～2）。以後又被差回帖撒羅尼迦去鼓勵、造就那邊的教會。及至保羅離開了雅典並開始在哥林多傳道之時，西拉與提摩太再一同「從馬其頓來」與保羅同工（徒十八1、5；帖前三6）。當保羅兩次從哥林多寫信給帖撒羅尼迦教會時，也都特別提到提摩太的名字（帖前一1；帖後一1）。
在第三次佈道旅程中（約A.D.53/54～57/58），提摩太與保羅在以弗所工作許久，從以弗所保羅又差他從陸路去馬其頓和哥林多（徒十九21～22；林前四17，十六10）。後來，又回到馬其頓和保羅會合（林後一1），此後隨同保羅到哥林多（羅十六21），與其他同工隨保羅回馬其頓，再先到特羅亞等候保羅（徒二十3～5）。之後，大概也跟保羅一起到了耶路撒冷（林前十六3）。再來的一段時間，聖經就未再提到提摩太的事蹟，直到保羅首次在羅馬坐監，兩人又再度有親密的屬靈接觸（腓一1；西一1；門1）。當保羅預料自己不久將被釋放時，他告訴腓立比信徒，要差遣提摩太先到他們那裡去（腓二24、29）。
接著又一段資料空白，直到保羅從羅馬監獄獲釋，重返亞西亞、馬其頓時，曾吩咐提摩太留在以弗所負責選拔教會領袖及牧養信徒的工作（約A.D.62）。由於提摩太年輕（提前四12），生性寡言怯懦（林前十六10；提後一6～7），且健康不佳（提前五23），面對重任和異端的危機，難免力有不逮。
因此，保羅在再訪以弗所之前，先寫提摩太前書（約A.D.63）給提摩太，對他多方鼓勵。當羅馬皇帝尼祿逼迫基督徒（約A.D.66），保羅因此再度被囚於羅馬獄中。他自覺沒有獲釋希望，面對殉道的可能性（提後一8、16，四6～8），遂寫信給遠在以弗所的提摩太，盼望他趕來相會，並給予這位年輕牧者有關個人生活及事奉的囑咐。
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